피터 파커(토비 맥과이어)는 메리 제인(커스틴 던스트)에 대한 사랑을 지키고 스파이더맨의 의무도 수행하며 대중들에게 사랑 받는 영웅으로 거듭난다. 하지만 외계에서 온 수수께끼의 유기체 심비오트에 감염되면서 블랙 슈트 스파이더맨으로 변화하고 만다. 더욱 강력해진 그는 자신의 힘에 도취되어 마음껏 세상을 즐긴다. 그런 가운데 아버지의 복수를 위해 뉴 고블린이 된 해리(제임스 프랭코)와 피터의 삼촌을 죽인 진범이자 물리 실험에 노출되어 막대한 능력의 샌드맨이 된 플린트(토마스 헤이든 처치)는 호시탐탐 스파이더맨을 노린다. 한편 피터의 직장 동료인 에디 브록(토퍼 그레이스)은 스파이더맨 특종들로 신문사의 영웅이 되지만, 여자친구로 인해 스파이더맨에게 증오의 감정을 갖게 된다. 그후 피터가 벗어 던진 심비오트가 전이되면서 브록은 가장 강력한 악당인 베놈으로 진화하는데…